高质量分辨率的空间代谢物定位增强了现有植物基因和途径发现的工具箱
代谢物是直接反映表型和功能变化的最终产物，检测代谢物是确定基因功能的关键;而代谢组学也已被广泛应用而发展成为一个重要的功能基因组学工具。
关于代谢物分布的信息被认为是组织水平基因功能的重要参数，因此空间分解代谢组学越来越被认为是一种重要的功能基因组学工具，其独特优势：(i)它能够检测高度空间定位的代谢物，这些代谢物通常在批量代谢组学分析中由于样本稀释效应而无法检测;(ii)它提供了精确的组织特异性、基因与代谢物的相关性，从中可以获得有关相关代谢物生物合成中涉及的基因功能的重要线索。近年来，MSI(MassSpectrometryImaging，质谱成像)已成为空间分解代谢组学最有效的工具之一。其中MALDI(基质辅助激光解吸/电离)是目前使用最广泛的MSI技术。
本研究证明了MSI可以结合不同的反向遗传学方法来阐明基因功能。
番茄(Solanumlycopersicum)果实[RNA沉默(RNAi)、病*诱导基因沉默(VIGS)]、本氏烟草(NicotianaBenthamiana)叶片组织[农杆菌介导法,农杆菌转化后7d采样]、白霜BL和光滑的CASL*2BS小麦(Triticumaestivum)[来自植物自然变异]的旗叶鞘；以上材料用于MALDI-MSI和LC-MS/GC-MS分析，甾体糖生物碱(SGAs)、花青素、甜菜素和表皮蜡质化合物检测均采用相对定量。每项研究设置三个生物学重复。
1、番茄：MALDI-MSIRNAi——追踪番茄果实中甾体糖生物碱的途径
甾体糖生物碱(SGAs)是茄科植物中一种含氮的特化代谢产物，c-5,6位置上双键的存在或缺失(分别称为不饱和和饱和)决定了SGAs之间巨大的结构多样性。在番茄中，α-番茄碱(α-tomatine，饱和)和脱氢番茄碱(dehydrotomatine，不饱和)是绿色果实组织中积累的主要SGAs，当番茄果实成熟并达到红熟阶段，α-番茄碱和脱氢番茄碱转化为各种饱和和不饱和的SGA衍生物(图1)。
图1.番茄果实发育过程中SGAs的生物合成：GAME25的沉默使整个“饱和”SGAs代谢谱转向不饱和SGAs的生产
在栽培番茄果实中，不饱和SGAs仅占饱和SGAs的2.5%至10%。而GAME25催化番茄果实中脱氢番茄碱(dehydrotomatidine，不饱和)转化为番茄碱(tomatidine，饱和)，为了进一步阐明GAME25在SGA代谢中的作用，利用RNAi对番茄植株中的GAME25进行沉默。GAME25转录水平在GAME25i番茄果实成熟期和成熟期红熟期均显著降低(p0.05)。主成分分析也显示GAME25i与野生型(WT)番茄果实在成熟青熟期和成熟红熟期的代谢谱有明显区别。由于α-tomatine和dehydrotomatine是绿色果实中主要的SGAs，首先利用MALDI成像比较了它们在WT和GAME25i绿色番茄果实中的分布和丰度。在WT和GAME25i番茄果实中均检测到这两种代谢产物，除了种子中丰度相对较低外，其余均均匀分布在果实各部位(图2a)。虽然空间定位相似，但在数量上差异显著：α-tomatine在WT中含量丰富，而dehydrotomatine在GAME25i中积累到较高水平(图2a)。
WT中α-tomatine的质量精度、WT和GAME25i中dehydrotomatine的质量精度均在可接受的质量精度窗口内(2ppm)，而在GAME25i番茄果实中，α-tomatine质量测量精度(MMA)严重下降：在m/z.处检测其质量精度为8ppm。仔细检查MALDI成像光谱显示，这是由于质量分辨率不足造成的(图2b-c)，在m/z处，区分相邻两个峰的最小质量分辨率约为R=,，因此，在m/z处进行了超高质量分辨率的MALDI成像，质量分辨率为R=万。在新的仪器设置下，这两个离子得到了很好的分离，在GAME25i果实中，α-tomatine离子的检测精度为-0.18ppm,m/z为.(图2e)。如图2a所示，果实表皮和果皮中均含有丰富的α-tomatine，但WT中α-tomatine含量较高，GAME25i中dehydrotomatine含量较高(图2d)。
图2.WT和GAME25i绿色番茄果实中dehydrotomatine和α-tomatine的MALDI成像。(a-c)MALDI成像R=,(m/z);(d-e)MALDI成像R=万(m/z)；比例尺2mm。
接下来对WT和GAME25i红熟阶段番茄果实的SGAs组成进行可视化和量化。通过MALDI成像(图3)和对组织匀浆的LC-MS分析确定了图1中所示的全部饱和和不饱和SGAs。结果表明，与野生型果实相比，沉默GAME25基因后，α-tomatine及其下游饱和SGA衍生物水平均显著降低。相比之下，成熟的红色成熟GAME25i果实中脱氢番茄碱及其下游不饱和SGA衍生物的含量均增加(图3b-c)。特别是MALDI图像显示，饱和SGAs及其各自的不饱和形式在WT和GAME25i果实中呈现出非常相似的分布模式:饱和和不饱和SGAs中间体主要积累在番茄果实的表皮层中。定量和分布信息共同表明，GAME25的沉默使整个饱和SGA代谢途径转向不饱和SGA分支，而饱和SGA的空间分布和它们各自的不饱和形态在WT和GAME25i中保持一致(图3)。
利用超高质量分辨率的测量来分辨等压物质(具有相同名义质量但不同单同位素质量的分子)增加了检测到的质量峰值的数量,提高了分子识别的可信度,保证了更精确的空间分布信息和定量信息。然而，数据采集时间显著增加。例如，当质量分辨率在m/z下从R=,提高到R=,时，总体分析时间从2h增加到超过20h。
图3.利用MALDI成像和LC-MS可视化WT和GAME25i成熟红熟番茄果实中SGAs通路。(a)简化的番茄果实SGA通路；(b)WT和GAME25i番茄果实SGAs的MALDI图像。MALDI图像的空间分辨率为65μm，Δm/z=±1ppm，比例尺2mm；(c)LC-MS比较WT和GAME25i的SGAs水平(n=3)。
2、番茄:MALDI-MSI病*诱导基因沉默(VIGS)——揭示基因与代谢产物的关系
在番茄中，DELILA(Del)和ROSEA1(Ros1)转录因子引发花青素积累形成紫色果实表型，对VIGS载体进行修饰使其包含部分Del和Ros1基因序列用于沉默，Del/Ros1和GOI的共沉默抑制了导致番茄红果表型的花青素积累(图4b)。与LC-或GC-MS分析样品提取物相比，MSI不需要手动对沉默或非沉默区域进行组织解剖。相反，在同一样本中多个表型的共存有利于不同表型的定量比较，因为样本间差异和批次处理效应被消除了。结合VIGS、MALDI成像和LC-MS研究了GAME31(图4a)，利用烟草鼓状病*(TRV)载体将Del/Ros1和GAME31基因片段分别转入番茄果实(E8
el/Ros1)成熟期，感染3-4周后，果实在紫色果实(非沉默区)背景上显示出清晰可见的红色区(沉默区)(图4b)。
图4.花青素介导的番茄果实GAME31基因VIGS可视化研究。(a)沉默GAME31后α-tomatine向其下游物质的转化被阻断；(b)花青素的非均匀积累区分了非沉默区(1:富含花青素)和沉默区(2:无花青素)；比例尺μm。
如图5a(2)-(4)所示，三种花青素的分布都与紫色的定位有很好的相关性，并且它们的离子强度随着紫色的着色程度而增加。使用MALDI和LC-MS进行定量比较证实，花青素在非沉默区显著较高(p0.)(图5bd)。除了作为引导组织解剖的可视化报告，花青素也是评估MALDI成像性能的理想质控，因为它们是有色化合物，其分布可以很容易地用肉眼分辨。
为了评估VIGS本身是否对SGAs代谢有任何影响，以仅含有Del/Ros1序列的TRV质粒(不含GOI)感染的E8el/Ros1番茄果实作为对照。代谢谱主成分分析显示，对照和GAME31-VIGS番茄果实的非沉默区聚在一起，而与其沉默区明显分离。采用MALDI成像技术在成熟对照果实中检测到α-tomatine和esculeosideA：EsculeosideA均匀定位于沉默区和非沉默区(图5a)，且MALDI成像和LC-MS结果均显示成熟果实中沉默区和非沉默区中两种主要SGA含量水平无显著差异，表明VIGS本身并不影响SGA代谢。
与对照果实相比，在GAME31-VIGS成熟果实中检测到高水平的α-tomatine(图5c,d)。MALDI图像显示，α-tomatine主要定位于GAME31-VIGS沉默区，其含量与花青素丰度呈负相关(图5c)。相对定量的MALDI成像和LC-MS数据显示，与非沉默区相比，沉默区α-tomatine含量显著更高(p0.01)(图5d)。此外，另外3个上游SGAs（dehydrotomatidine、tomatidine和dehydrotomatine）也都单独定位于GAME31-VIGS番茄果实的沉默区。
如本例所示，由于相应代谢物的分布模式与基因沉默模式高度相关，因此VIGS与MALDI成像相结合提供了一种直接的方法来研究确切的基因代谢物关系。
图5.利用MALDI成像和LC-MS在对照和GAME31-VIGS红熟番茄果实中对花青素和主要SGAs进行定位和定量比较。(a,c)对照和GAME31-VIGS番茄果实的MALDI图像（空间分辨率μm,Δm/z=±5ppm），比例尺5mm；(b,d)利用MALDI成像和LC-MS比较对照和GAME31-VIGS番茄果实非沉默区和沉默区代谢物水平(n=3)。
3、烟草：MALDI-MSI农杆菌转化法——快速基因功能分析
本例利用农杆菌转化法在本氏烟草叶片中生产甜菜素并利用MALDI成像技术检测转化后叶片中的代谢变化。红甜菜BvDODA1和CYP76AD1基因与紫茉莉cDOPA5GT基因共渗后产生甜菜红素（betacyanins）(pX11质粒;图6)，而CYP76AD6和BvDODA1的表达导致了甜菜*素（betaxanthins）的积累(pX13质粒;图6)。
图6.本氏烟草叶片中CYP76AD1和CYP76AD6的瞬时表达合成甜菜素。
利用MALDI成像对转化后的本氏烟草叶片进行分析发现甜菜素（betalains）很容易在冷冻切片中检测到质子化离子([M+H]+)。4种甜菜红素在px11渗透叶片中特异鉴定，其中两种已知的甜菜素（betanin、betanidin）定位与红紫色的空间分布高度相关(图7a)。同样，在px13渗透的叶区检测到3种甜菜*素，MALDI成像显示甜菜*素（vulgaxanthin、dopaxanthin-hexoside）只在px13渗透叶区积累(图7a)。此外，betalamicacid(m/z.,C9H9NO5)作为甜菜*素生物合成途径的中间体，也仅局限于pX13渗透叶区。叶绿素a用于初步评估MALDI成像性能，MALDI图像显示叶绿素a均匀分布在pX11和pX13表达叶段(图7a)，说明整个MALDI成像系统的性能是最优的。
转化后本氏烟草叶片的LC-MS提取分析证实了MALDI成像的结果，pX11和pX13渗透叶区检测到的甜菜红素和甜菜*素均显著升高(p0.01)(图7b)。植物色素包括从非极性类胡萝卜素和叶绿素到极性花青素和甜菜碱的各种化合物，因此一个LC-MS工作流同时检测他们是不可能的，例如本研究中检测甜菜素的专用LC-MS方法无法检测到本氏烟草叶片中的叶绿素(图7b)。而这四大类植物色素可以在单一的MALDI成像分析中同时检测到。此外，从MALDI成像中获得的空间信息也可以用于协助代谢物鉴定。例如，在LC-MS中有三个未知峰，他们的空间分布与色素沉积区域之间的高度相关性证实了这些离子与甜菜素相关的身份。
由于农杆菌转化能够将多个载体引入单一叶片的不同区域，因此MSI与其联合可以应用于类似微阵列的方法，对同一样品进行多次分析，为候选基因功能的初步鉴定、基因产物的检测和定位提供了一种快速有效的方法。
图7.利用MALDI成像和LC-MS对烟草转化后叶片的甜菜素和叶绿素a进行定位和定量比较。(a)PX11、PX13表达及对照的本氏烟叶MALDI成像，空间分辨率为60μm,Δm/z=±5ppm，比例尺1mm；(b)利用MALDI成像和LC-MS对表达PX11、PX13的本氏烟叶中甜菜红素(3-4)、甜菜*素(8-9)和叶绿素a(5)进行定量比较(n=3)。
4、小麦：MALDI-MSIGC-MS——表皮蜡质的高质量准确性MSI表型
在小麦中，β-二酮是使茎、叶和花头呈现蓝灰色(白霜色)的主要表皮蜡质(EW)成分，野生小麦种中既有白霜表型也有光泽表型。本例使用MALDI成像和GC-MS比较了白霜BL和光滑的CASL*2BS小麦株系之间EW的组成、丰度和分布(图8a)。
为了减少批量效应和样品制备过程中可能出现的变化，将BL和CASL*2BS两个品种的旗叶鞘解剖并粘贴在同一载玻片上，然后通过MALDI成像将其分析为“一个样本，两个表型”(图8b)。首先对获得的MALDI成像数据进行二分k均值算法聚类，根据化学成分对两个小麦品系进行图像分割，结果很好地代表了三个聚类样本的形态区域：*色簇为BL旗叶鞘，紫色簇为CASL*2BS旗叶鞘，绿色簇为两组织之间的空白区域(图8b)。
除了突出显示不同的解剖区域，分割图也可以用来识别与这些区域相关的质量峰。共发现个质量峰与BL或CASL*2BS旗叶鞘高度共定位，Pearson相关系数大于0.85（p≤0.05）。根据MALDI成像的准确质量和同位素模式、组织提取物的GC-MS结果和已有发现初步确定了其中的95个，其中48个质量峰对应21个代谢物共定位于旗叶鞘，它们均匀分布在叶鞘上，以C31羟基-β二酮和C31β二酮为主要代谢产物，占总蜡质量的79%，是导致BL小麦品种出现白霜的原因(图8c)；此外，微量的C29羟基-β-二酮和C29β-二酮仅通过MALDI成像检测，表明其在代谢物检测方面与GC-MS具有互补性。与CASL*2BS旗叶鞘共定位的48个质量峰分别对应25个代谢物，其中C24、C26、C28、C30和C32伯醇是最常见的蜡质种类，这与GC-MS数据和以往报道一致，表明β二酮的缺失是由伯醇的增加来弥补的。之前的研究结果表明有3个候选基因(DMP、DMH和DMC)编码β-二酮生物合成酶，它们在BL中显著表达，但在光滑的CASL*2BS中受到抑制。通过MALDI成像揭示的β-二酮积累与的三个基因表达模式相关性进一步支持了它们在小麦β-二酮生产中的功能。
本研究采用非针对性的空间分割方法，寻找小麦旗叶鞘中区分白霜和光滑表型的所有相关生物标志物。在MALDI成像中，使用高质量分辨率、高质量精度和锁定质量功能可以在1ppm质量精度内直接测定大多数生物标志物的元素组成（m/z小于Da）。由于元素组成是任何进一步鉴定的基础，元素组成的直接赋值能力极大地便利了MSI中的生物标志物鉴定过程。
图8.利用MALDI成像和GC-MS对BL和CASL*2BS小麦旗叶鞘中表皮蜡质的表征。(a)小麦旗叶鞘表皮蜡的光学显微镜(2)和低温扫描电镜(1,3)图像；(b)BL和CASL*2BS旗叶鞘的MALDI成像结果分割图分析；(c,d)BL和CASL*2BS旗叶鞘中二酮类和醇类物质的定量比较(n=3)。
MSI中缺乏对新基因相关代谢物的“发现”型分析，主要由于
i)代谢物的高可信度鉴定困难，(ii)检测到的代谢物数量相对较少；与LC-或GC-MS不同，MSI直接在样品组织表面分析分子，而不需要事先提取或色谱分离，因此代谢物注释主要根据分子的m/z值、同位素分布和串联质谱破碎模式；此外,与MSI相关的限制还包括：缺乏色谱分离使得MSI容易产生离子抑制效应，尤其对于复杂生物样品；难以区分同分异构体。
从VIGS或农杆菌介导产生的样本中分离不同的表型材料进行LC或GC-MS分析费时费力，而MSI则是此类样品类型的完美工具，因为它不需要任何手动组织解剖和分离，而且不存在批次效应。本研究实例表明，通过MSI中获得丰富的空间信息与传统的LC-或GC-MS结合可以作为一种有效的空间代谢组学工具来发现整体代谢变化与特定器官、组织或细胞的关联。
由于MSI能够提供定位代谢物的高空间和时间分辨率图像，因此MSI有可能更好地理解组织或细胞特异性基因的基因功能。特别是使用超高质量分辨率和高质量精度的MSI显著提高了代谢物的检测，消除了等压离子的干扰，从而允许发现新的基因相关代谢物和更准确的基因-代谢物关系。
本文介绍了MSI在植物科学中的应用现状和技术进展，讨论了目前MSI与反向遗传学结合推断基因功能的局限性、优势和机遇，阐述了MSI在植物特化代谢研究中的重要贡献。本研究发现将MSI与(i)RNA沉默(RNAi)、(ii)病*诱导的基因沉默(VIGS)、(iii)农杆菌介导或(iv)来自植物自然变异的样本相结合，为理解准确的基因-代谢物关系和发现新的基因相关代谢物提供了一种快速、经济的方法。
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